水稻基因编辑实验方法

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posted on 24 Jul 2022 under category 自然科学

水稻基因编辑实验方法

一句话总结：让种子萌芽产生伤口，将伤口泡在有基因编辑/修改载体的营养液中，从而修改秧苗伤口处的基因，再对伤口处新生组织再生培养，就可以批量生成基因编辑/修改过的秧苗了。

参考：利用CRISPR-Cas9系统进行水稻OsMADS15基因的定向编辑

实验材料 本研究采用的水稻材料是粳稻生态型9522(‘武运粳7号’)。 本研究所有植物基因组定点编辑CRISPRCas9载体均为来自朱健康实验室的pBin-sgR-CasOsCH载体。构建载体所用的大肠杆菌菌株为DH5α, 农杆菌菌株为EHA105。

载体构建 … 将连接产物按《分子克隆实验指南》所述步骤转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。鉴定正确的质粒进一步按《分子克隆实验指南》所述步骤热激法转化EHA105农杆菌感受态。再取单菌落扩繁进行菌液PCR鉴定, 取阳性菌液用于转化水稻愈伤组织。

（修改大肠杆菌的质粒基因，然后将这个质粒转移到农杆菌体内，再用这种特殊农杆菌去感染水稻愈伤组织？）

水稻的遗传转化

  1. 将水稻种子去壳后先用水洗干、消毒、灭菌。
  2. 将种子置于培养基平板上, 于26°C下暗培养10~14 d。
  3. 黄色愈伤组织长出后, 用刀片切下诱导出来的新愈伤组织, 在新的培养基上培养10 d后用于转化。
  4. 将愈伤组织放入农杆菌悬液中, 轻柔震荡。
  5. 取出愈伤组织, 放在培养基的平板上, 于28°C下暗培养3d。
  6. 取出愈伤组织, 于滤纸上晾干后放在培养基平板上筛选10d，将新长出的愈伤组织放在分化培养基平板上, 光下培养10d，直到幼苗长出。
  7. 将无根幼苗移入含有生根培养基的试管中, 诱导生根。
  8. 当根形成后, 把苗移入温室。

植物基因过表达技术

基因过表达是指将一目标基因克隆到一个携带有强启动子和抗性筛选标记等元件的载体上，然后导入植物体内，这样宿主细胞会获得较高量的目标mRNA转录水平和蛋白表达水平，从而研究该基因的功能。

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。 启动子作为RNA聚合酶和一些转录因子结合的靶序列，对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。因此启动子的识别与分析是表达调控研究的前提和基础。

在双子叶植物中过量表达某个目的基因大多采用人工改造后的花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子，在单子叶植物如水稻中常采用泛素启动子。

为了获得过量表达目的基因的转基因植株，首先需要选择合适的植物转基因载体。过表达载体主要是将目的基因的编码区构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。

载体构建，为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。