转基因小白鼠对抗体类药物研发的重要意义
posted on 22 Sep 2021 under category 生命科学
现在科学家可以修改小白鼠的基因，将人类抗体生成基因移植过去，从而让小白鼠产生非常类似人的抗体（抗体是免疫系统随机生成的）。
通过克隆技术，不断复制这种产生人类抗体的老鼠，养上成百上千只。
给这些老鼠注射癌症、埃博拉、新冠 等各种人类疑难杂症，看看最后哪些老鼠活下来。
分析这些最终活下来老鼠的体内抗体，就可以筛选出可以治疗这些疾病的抗体和分泌这些抗体的B细胞。
再大规模培养这些B细胞，或者基因改造某些细菌，源源不断生成这些抗体，就可以用来给人治病了。
4只转基因小鼠的前世今生和传奇故事
目前世界上共有4个转基因小鼠平台产生的抗体已经获得FDA批准上市。不但用事实验证了这些平台的有效性，也是这些平台将来用于抗体药研发时所产生的知识产权和专利权益的保证。
Medarex 所属公司百时美施贵宝
Medarex 、Abgenix作为第一代的转基因小鼠，很长时间内几乎垄断了这个领域的抗体药物。尤其是Medarex的HuMAb平台，累计获批了10个抗体药物，其中就包括PD-1抗体Opdivo。
通过HuMAb原研公司Genpharm 相关专利可以看出，HuMAb-MouseTM技术平台的构建从1991年始(US5569825)一直延续到1997年(US5874299)。
1997年日本开发了转染色体技术，2000年日本麒麟公司用2个HAC载体分别将人IGH和IGK基因导入小鼠产生了TC mouse，2000年Medarex与麒麟公司建立战略合作，通过杂交将HuMAbκ轻链与TC小鼠的重链组合，命名为KM小鼠（两家公司的首字母）,它包含了TC小鼠的人IGH与HuMAb小鼠的人IGK基因，整合了TC小鼠IGH的多样性与HuMAb小鼠IGK的稳定性，能产生大部分的Ig亚类（IgG1-IgG4以及IgA），建立了“日美混血”的KM mouse技术。
到了2005年，除了KM小鼠技术外，Medarex的技术组合还包括噬菌体展示技术、抗体药物耦合（ADC）技术和Potelligent技术。所有这些技术被统一放在一个大的技术平台里，称之为UltiMAb技术,或终极单抗技术。2009年，百时美施贵宝公司以24亿美元的价格收购了Medarex公司并获得了该技术平台。
Xenomouse 所属公司安进
Abgenix公司的XenoMouse小鼠也是目前最为成功、应用最广的转基因小鼠之一。Abgenix 涉及XenoMouse平台的专利从1992年始(US5939598)一直延续到2005年(US7820877)。
Abgenix于1997年在《自然遗传》上发表的论文标志着XenoMouse技术平台的成熟。Abgenix公司XenoMouse小鼠整合入大部分人抗体VH和Vκ基因，大小分别为1020kb和800kb。他们的另一个重要发现是引进的DNA片断的大小不仅仅影响抗体库的规模，也影响B细胞发育和数量。引进的片断越大，成熟和未成熟的B细胞的数量也越接近自然状态。
XenoMouse小鼠基因非常稳定，经该平台技术制备的全人治疗性候选抗体有200个以上，数十个抗体处于临床试验阶段，其中6个抗体药物获得FDA批准上市，2005年安进公司以22亿美元的价格收购了Abgenix公司。
在Medarex和Abgenix被收购后，UltiMAb和XenoMouse技术平台分别在BMS和安进内部不断地升级换代，但它们的对外转让、使用受到了限制。
VelocImmune mouse 所属公司再生元Regeneron
2009年，在Medarex和Abgenix退隐之后，又出现第三只小鼠，Regeneron用人抗体重链可变区和轻链可变区基因分别原位替换小鼠抗体基因的可变区片断，产生了VelocImmune小鼠。
Regeneron从2011年起在中国进行了一系列专利布局CN104342455B/ CN104024418B/ CN103917650B/ CN102711449B/ CN103154255B/ CN104540383B/ CN104202971B。
利用Veloclmmune小鼠技术平台，Regeneron与赛诺菲联合开发了PCSK9的全人源单抗药物，于2015年经FDA批准上市，截至目前已经上市4款全人源抗体药物。
Veloclmmune小鼠技术平台，不同于以往的转基因小鼠抗体平台，它产生人源抗体可变区与鼠源抗体恒定区组成的反向嵌合抗体。该类转基因小鼠免疫后产生的抗体可变区编码序列需要通过基因克隆技术与人源恒定区编码序列进行重新构建，转变为全人源抗体。
该平台的优点是保留了鼠IGH恒定区通过B细胞胞质区的信号转导区域传递天然的免疫信号，并通过与其他类型免疫细胞上的Fc受体的结合促使小鼠产生强大的免疫反应。
TC mouse 一代TC mouse所属日本麒麟公司 二代TC-mAbTM所属TC公司
目前全球第四个FDA批准单抗药物上市的全人源抗体转基因小鼠平台是TC mouse，2018年迎来首个上市抗体药物FGF-23抗体Burosumab。
第一代TC mouse利用转染色体技术以人染色体（HAC）为载体，分别携带完整的人抗体基因IGH和IGK导入小鼠胚胎干细胞，使小鼠携带了42条染色体。由于人染色体在小鼠体内的异源性，以及染色体数目由原来的20对变为21对，导致第一代TC mouse在细胞分裂时传代不稳定，携带IGK的染色体经多次传代会发生丢失现象。
第二代TC-mAbTM小鼠为了解决染色体不稳定的问题，将人染色体（HAC，Human Artificial Chromosome ）载体改为鼠染色体（MAC, Mouse Artificial Chromosome），避免了人染色体在小鼠体内的异源性。分别构建了包含人（IGH+IGK）和（IGH+IGλ）的MAC载体，将这种携带人抗体基因的MAC载体导入含有39条染色体的小鼠胚胎干细胞，从而获得正常的20对染色体的整倍体胚胎干细胞，由此产生了第二代TC-mAbTM小鼠。通过这次技术升级使第二代TC-mAbTM获得了非常稳定的染色体遗传性状，经多次传代无染色体丢失现象发生。并且第二代TC-mAbTM小鼠携带了完整的人IGH/IGK/IGλ抗体基因座，从理论上实现了抗体基因真正意义上的100%全人源，其调控区、编码区、和间隔序列的完整性使得抗体库的规模以及抗体基因的表达调控更加接近自然状态，最大限度保证了抗体多样性。
目前第二代TC-mAbTM小鼠已经在美、中、日申请了专利CN 109906272A；US20120272342A1;WO2018079857A1。
由于一旦获得了合适的转基因小鼠，对于开发抗体药物的意义将是巨大的。除了以上四个已经成药的全人源抗体转基因小鼠平台，为了打破这种稀缺技术的垄断性，突破全人源单抗药物研发的瓶颈，一些新创公司和团队也在积极推进自主知识产权的新平台，如KYmouse、TRIANNI mouse、AlivaMab mouse、OminiRat/Mouse、H2L2 Tg Mice、Renmouse、CAmouse等，多个管线都在推进中，正在经历有效性和专利权益的检验。
关于全人源抗体转基因小鼠的几个问题
01 影响全人源抗体转基因 小鼠抗体多样性的因素
由于一些技术的限制，无法转入大的基因座以及小鼠体内的抗体基因没有灭活或灭活不充分，导致人抗体的基因多样性不够，多样性越高，产生高亲和性、高成药性的抗体的概率越大。基因结构（包括顺式作用元件、调控元件等）的不完整和顺序混乱也会影响免疫应答过程。另外，引进的DNA片断的大小不仅影响抗体库的规模，也影响B细胞发育和数量。引进的片断越大，成熟和未成熟的B细胞的数量也越接近自然状态。
02 全人源抗体转基因小鼠抗体恒定区 为人源/鼠源与成药性的关系
保留鼠源抗体恒定区，有利于小鼠体内免疫信号传递。但是，后续需要进行抗体恒定区的转变，将鼠源恒定区转变为人源恒定区，而这有可能会丢失抗体原本的特性，因为抗体的重链恒定区会影响其相应可变区的结构和功能。当可变区从它原本的恒定区构建进入不同物种或不同抗体类型的恒定区，产生抗体的亲和力与表位的识别能力都可能发生改变。
03 免疫原性问题
免疫原性问题：人源化抗体、全人源抗体、天然全人源抗体，其技术特点与抗体的免疫原性并无绝对联系。人体的免疫系统极其复杂，MHC基因型、免疫耐受等都决定了免疫原性不会因为筛选平台来源而可以绝对的避免。好的人源化抗体改造以及全人源抗体，都可以减少免疫原性发生的概率，但仍需针对免疫原性做完整、系统的评估。
江山代有才人出，各领风骚数百年。这是一个抗体药大爆发的时代，转基因小鼠技术凭借其绝妙的构思、精巧的技术、巨大的贡献站上了抗体药浪潮的风口浪尖，伴随着一个个神奇药物的诞生，转基因小鼠和它的科学家们还在继续书写他们的传奇故事。